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免疫扩散实验(双向双扩散)——生物技术第四组

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  免疫扩散实验(双向双扩散) 2010级生物技术第四组 实验目的 ? 了解双向琼脂扩散的原理和用途。 ? 掌握抗体效价的测定方法。 ? 观察抗原、抗体在琼脂板中形成的沉淀线。 实验原理 ? 双向双扩散简称双扩散,此法是一种定性 试验。可溶性抗原与相应的抗体在琼脂凝 胶中各自向四周扩散,如果抗原和抗体相 对应,则在二者比例适当处形成白色沉淀 线;若抗原和抗体无关就不会出现沉淀线。 此试验可以检测抗原或抗体的纯度,滴定 抗体的效价,以及用已知抗原(抗体)检 测和分析未知抗体(抗原)。 实验材料 ? 生理盐水、1%琼脂(用于制作琼脂扩散试 验平板) ? 已知传染性法氏囊病毒抗原、待检血清 ? 打孔器、微量加样器、枪头、酒精灯、搪 瓷盒等 实验步骤 1. 制板:称取1g琼脂粉,加入100ml生理盐水, 煮沸使之溶解。待溶解的琼脂温度降至60℃左 右时倒入平皿中,厚度为2-3mm。注意勿产生 气泡。 2. 打孔:待琼脂凝固好后用打孔器打孔,孔径和 孔距依不同疫病检疫规程而定,一般孔径 3~5mm,孔间距4~7mm。孔型多为7孔,中央 1孔,周围6孔(如梅花孔)。用针头挑出孔内 琼脂。 3. 封底:将琼脂板无凝胶面在酒精灯火焰上轻轻 灼烧,用手背感受微烫即可。 4. 抗体效价测定:用微量加样器于中央孔加 入已知抗原,于周围孔加倍比稀释的血清, 每个稀释度加1孔。加样时不要使样品外 溢或在边缘残存小气泡,以免影响扩散结 果。 5. 扩散:加样完毕后,将琼脂板放于湿盒内, 保持一定的湿度,置于37℃温箱中扩散 24~48小时观察结果。 图1 结果判定 1. 用以检测抗原或比较抗原差异时,将抗血 清置中心孔,将待测抗原或需比较的抗原 置于周围相邻孔。若出现沉淀带完全融合, 证明为同种抗原;若二者有部分相连,表 明二者有共同抗原决定簇;若二条沉淀线 相互交叉,说明二者抗原完全不同。 结果判定 用梅花孔检测抗血清的效价,操作时将抗原置 于中心孔,抗血清倍比稀释后置于周围孔,以 出现沉淀带的血清最高稀释倍数为该血清的琼 扩效价。 ? 若凝胶中抗原、抗体是特异性的,则形成抗原 抗体复合物,在两孔之间出现清晰致密的白色 沉淀线小时内仍未出现 沉淀线则为阴性反应。实验时至少要做一阳性 对照。出现阳性对照与备检样品的沉淀线发生 融合,才能确定待检样品为真正阳性。 ? 双向免疫扩散凝胶染色图 注意事项 ? 浇制琼脂板时要均匀、无气泡。 ? 孔要打得圆整光滑,边缘不要破裂。 ? 加样时应尽量避免气泡或加到孔外,以保 证结果的准确性。 ? 注意微量进样器每加一个样品之后,更换 枪头。 思考题 ? 如何进行血清琼扩效价的测定?

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